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Regolamento (CE) n. 999/2001 del Parlamento europeo e del Consiglio del 22 maggio 2001 recante disposizioni per la prevenzione, il controllo e l'eradicazione di alcune encefalopatie spongiformi trasmissibili

Testo vigente

ALLEGATO X

ALLEGATO X LABORATORI DI RIFERIMENTO, CAMPIONAMENTO E METODI DI LABORATORIO

CAPITOLO B Laboratorio UE di riferimento

CAPITOLO C Campionamento e analisi di laboratorio

1. Campionamento

Qualsiasi campione che si intenda esaminare per verificare la presenza di una TSE deve essere prelevato utilizzando i metodi e i protocolli indicati nell'ultima edizione del Manuale sulle prove diagnostiche e i vaccini per gli animali terrestri dell'Organizzazione mondiale della sanità animale (OIE) (di seguito «il manuale»). Oltre a, o in assenza di, metodi e protocolli dell'OIE e affinché vi sia materiale sufficiente, l'autorità competente deve garantire l'uso di metodi e protocolli di campionamento in conformità degli orientamenti emessi dal laboratorio UE di riferimento. In particolare l'autorità competente deve raccogliere i tessuti appropriati, conformemente ai pareri scientifici disponibili e alle linee guida del laboratorio UE di riferimento, al fine di garantire l'individuazione di tutti i ceppi noti di TSE nei piccoli ruminanti e deve conservare almeno la metà dei tessuti raccolti al fresco, ma non congelati, finché il test rapido non risulti negativo. Qualora il risultato sia positivo o non conclusivo, i tessuti residui devono essere sottoposti a esami di verifica e successivamente devono essere trattati conformemente alle linee guida del laboratorio UE di riferimento sui test di differenziazione e la classificazione — «TSE strain characterisation in small ruminants (Caratterizzazione del ceppo di TSE nei piccoli ruminanti:): A technical handbook for National Reference Laboratories in the EU (Manuale tecnico per i laboratori nazionali di riferimento nell'UE)». I campioni vanno contrassegnati correttamente, in modo da identificare l'animale sottoposto a campionamento.

2. Laboratori

Ogni esame di laboratorio per accertare la presenza di una TSE è condotto in laboratori diagnostici ufficiali debitamente autorizzati dall'autorità competente.

3. Metodi e protocolli

3.1. Analisi di laboratorio per accertare la presenza di BSE nei bovini

a) Casi sospetti

I campioni di bovini da analizzare in laboratorio a norma delle disposizioni dell'articolo 12, paragrafo 2, sono immediatamente sottoposti a esami di verifica ricorrendo ad almeno uno dei seguenti metodi e protocolli descritti nell'ultima edizione del manuale:

  1. i) metodo immunoistochimico (IHC);

  2. ii) Western blot;

  3. iii) dimostrazione delle caratteristiche fibrille mediante microscopia elettronica;

  4. iv) esame istopatologico;

  5. v) combinazione di test rapidi definiti nel terzo comma.

Se l'esame istopatologico dà un risultato negativo o non conclusivo, i tessuti sono sottoposti a un ulteriore esame mediante uno degli altri metodi e protocolli di verifica.

I test rapidi possono essere utilizzati sia per uno screening preliminare dei casi sospetti sia, in caso di esito positivo o non conclusivo, per una successiva verifica, secondo gli orientamenti del laboratorio UE di riferimento — «OIE rules for the official confirmation of BSE in bovines (based on an initial reactive result in an approved rapid test) by using a second rapid test [Regole OIE per la conferma ufficiale della BSE nei bovini (in base ad un risultato iniziale reattivo in un test rapido approvato) tramite ricorso ad un secondo test rapido]» e purché:

i) la verifica sia effettuata in un laboratorio di riferimento nazionale per le TSE; e

ii) uno dei due test rapidi sia un Western blot; e

iii) il secondo test rapido utilizzato:

preveda un controllo di tessuto negativo e un campione di bovino affetto da BSE come controllo di tessuto positivo,

sia di tipo diverso dal test utilizzato per lo screening preliminare; e

iv) se come primo test è utilizzato un test rapido Western blot, il risultato venga documentato e l'immagine blot presentata al laboratorio di riferimento nazionale per le TSE; e

v) ove il risultato dello screening preliminare non venga confermato dal test rapido successivo, il campione venga sottoposto ad esame mediante uno degli altri metodi di verifica; se l'esame istopatologico dà un risultato negativo o non conclusivo, i tessuti siano sottoposti a un ulteriore esame mediante uno degli altri metodi e protocolli di verifica.

Se il risultato di uno degli esami di verifica di cui ai punti da i) a v), del primo comma è positivo, gli animali sono considerati casi positivi di BSE.

b) Sorveglianza della BSE

I campioni di bovini da analizzare in laboratorio, a norma delle disposizioni dell'allegato III, capitolo A, parte I, sono sottoposti a test rapido. Se il test rapido dà un risultato positivo o non conclusivo, il campione è immediatamente sottoposto a esami di verifica ricorrendo ad almeno uno dei seguenti metodi e protocolli descritti nell'ultima edizione del manuale:

  1. i) metodo immunoistochimico (IHC);

  2. ii) Western blot;

  3. iii) dimostrazione delle caratteristiche fibrille mediante microscopia elettronica;

  4. iv) esame istopatologico;

  5. v) combinazione di test rapidi definiti nel quarto comma.

Se l'esame istopatologico dà un risultato negativo o non conclusivo, i tessuti sono sottoposti a un ulteriore esame mediante uno degli altri metodi e protocolli di verifica.

I test rapidi possono essere utilizzati sia per uno screening preliminare sia, in caso di esito positivo o non conclusivo, per una successiva verifica, secondo gli orientamenti del laboratorio UE di riferimento — «OIE rules for the official confirmation of BSE in bovines (based on an initial reactive result in an approved rapid test) by using a second rapid test [Regole OIE per la conferma ufficiale della BSE nei bovini (in base ad un risultato iniziale reattivo in un test rapido approvato) tramite ricorso ad un secondo test rapido]» e purché:

i) la verifica sia effettuata in un laboratorio di riferimento nazionale per le TSE; e

ii) uno dei due test rapidi sia un Western blot; e

iii) il secondo test rapido utilizzato:

preveda un controllo di tessuto negativo e un campione di bovino affetto da BSE come controllo di tessuto positivo,

sia di tipo diverso dal test utilizzato per lo screening preliminare; e

iv) se come primo test è utilizzato un test rapido Western blot, il risultato venga documentato e l'immagine blot presentata al laboratorio di riferimento nazionale per le TSE; e

v) ove il risultato dello screening preliminare non venga confermato dal test rapido successivo, il campione venga sottoposto ad esame mediante uno degli altri metodi di verifica; se l'esame istopatologico dà un risultato negativo o non conclusivo, i tessuti siano sottoposti a un ulteriore esame mediante uno degli altri metodi e protocolli di verifica.

Un animale è considerato un caso positivo di BSE se il risultato del test rapido è positivo o non conclusivo e almeno uno degli esami di verifica di cui ai punti da i) a v), del secondo comma è positivo

c) Ulteriore esame dei casi positivi di BSE

I campioni di tutti i casi positivi di BSE devono essere trasmessi a un laboratorio designato dall'autorità competente che abbia partecipato con successo alle più recenti prove valutative organizzate dal laboratorio di riferimento dell'Unione europea per i test discriminatori dei casi confermati di BSE per essere sottoposti a ulteriori esami conformemente ai metodi e ai protocolli descritti nel metodo del laboratorio UE di riferimento per la classificazione degli isolati bovini delle TSE (un metodo two-blot per la classificazione provvisoria degli isolati bovini delle TSE).

  1. a)

  2. b)

3.2. Analisi di laboratorio per accertare la presenza di BSE negli ovini e nei caprini

a) Casi sospetti

I campioni di ovini e caprini da analizzare in laboratorio a norma delle disposizioni dell'articolo 12, paragrafo 2, sono immediatamente sottoposti a esami di verifica ricorrendo ad almeno uno dei seguenti metodi e protocolli descritti nell'ultima edizione del manuale:

  1. i) metodo immunoistochimico (IHC);

  2. ii) Western blot;

  3. iii) dimostrazione delle caratteristiche fibrille mediante microscopia elettronica;

  4. iv) esame istopatologico.

Se l'esame istopatologico dà un risultato negativo o non conclusivo, i tessuti sono sottoposti a un ulteriore esame mediante uno degli altri metodi e protocolli di verifica. I test rapidi possono essere utilizzati per uno screening preliminare dei casi sospetti. A tali test non è possibile ricorrere per una successiva verifica. Ove il risultato del test rapido utilizzato per lo screening preliminare dei casi sospetti sia positivo o non conclusivo, il campione è esaminato effettuando uno degli esami di verifica di cui ai punti da i) a iv), del primo comma. Se l'esame istopatologico dà un risultato negativo o non conclusivo, i tessuti sono sottoposti a un ulteriore esame mediante uno degli altri metodi e protocolli di verifica. Se il risultato di uno degli esami di verifica di cui ai punti da i) a iv) del primo comma è positivo, gli animali sono considerati casi positivi di TSE.

b) Sorveglianza della TSE

I campioni provenienti da ovini e caprini e inviati ai laboratori a fini di controllo, conformemente alle disposizioni dell'allegato III, capitolo A, parte II (Sorveglianza negli ovini e nei caprini), sono sottoposti a test rapido al fine di garantire l'individuazione di tutti i ceppi noti di TSE. Se il test rapido dà un risultato positivo o non conclusivo, i campioni di tessuti sono immediatamente inviati a un laboratorio ufficiale per gli esami di verifica mediante istopatologia, immunoistochimica, Western blotting o dimostrazione delle caratteristiche fibrille mediante microscopia elettronica, come indicato alla lettera a). Se il risultato dell'esame di verifica è negativo o non conclusivo, si procede a ulteriori esami mediante immunoistochimica o Western blotting. Se il risultato di uno degli esami di verifica è positivo, gli animali sono considerati casi positivi di TSE.

c) Ulteriore esame dei casi positivi di TSE

I campioni che, a seguito degli esami di cui alle lettere a) o b), sono considerati casi positivi di TSE, ma che non sono considerati casi atipici, sono esaminati per escludere la presenza di BSE solo se provengono da un caso indice. Sono esaminati, al fine di escludere la presenza di BSE, anche altri casi aventi caratteristiche che, secondo il laboratorio che esegue i test, richiedono maggiori accertamenti.

i) Analisi molecolare iniziale con metodo discriminatorio Western blotting

Per escludere la presenza di BSE, i campioni sono esaminati mediante un metodo discriminatorio Western blotting elencato negli orientamenti del laboratorio UE di riferimento. L’esame discriminatorio è eseguito da un laboratorio ufficiale designato dall’autorità competente, che abbia partecipato con successo alle più recenti prove valutative organizzate dal laboratorio UE di riferimento in relazione all’impiego di tale metodo.

ii) Analisi molecolare secondaria con ulteriori metodi di analisi molecolare

I casi di TSE in cui la presenza della BSE non può essere esclusa secondo gli orientamenti emessi dal laboratorio UE di riferimento mediante l’analisi molecolare iniziale di cui al punto i) devono essere immediatamente inoltrati al laboratorio UE di riferimento, accompagnati da tutte le informazioni pertinenti disponibili. I campioni devono essere sottoposti ad ulteriori analisi e verifiche mediante almeno un metodo alternativo, che differisca sotto il profilo immunochimico dal metodo molecolare iniziale. La struttura dell’analisi molecolare secondaria, in conformità alle conoscenze scientifiche e alle competenze di laboratorio più recenti, deve essere approvata caso per caso dal laboratorio UE di riferimento, come illustrato nei suoi orientamenti. Il laboratorio UE di riferimento è assistito da un gruppo di esperti denominato Strain Typing Expert Group, STEG (gruppo di esperti in materia di tipizzazione dei ceppi) e da un rappresentante del competente laboratorio nazionale di riferimento. I risultati sono interpretati dal laboratorio UE di riferimento, assistito dallo STEG e da un rappresentante del competente laboratorio nazionale di riferimento. La Commissione è informata immediatamente dei risultati dell’interpretazione.

iii) Biotest sui topi

I campioni che indicano la presenza di BSE e i campioni non conclusivi in seguito all'analisi molecolare secondaria sono ulteriormente analizzati con biotest sui topi per ottenere una conferma definitiva. La natura o la quantità del materiale disponibile possono influire sulla struttura del biotest che sarà approvato dal laboratorio UE di riferimento assistito dallo STEG caso per caso. I biotest saranno effettuati dal laboratorio UE di riferimento oppure da laboratori da questo designati. I risultati sono interpretati dal laboratorio UE di riferimento, assistito dallo STEG. La Commissione è informata immediatamente dei risultati dell'interpretazione.

  1. i)

  2. ii)

d) Laboratori autorizzati a effettuare ulteriori esami con metodi di tipizzazione molecolare:

  1. a)

  2. b)

3.3. Analisi di laboratorio per accertare la presenza di TSE in specie diverse da quelle di cui ai punti 3.1 e 3.2

Qualora siano definiti metodi e protocolli per i test effettuati al fine di confermare la presenza di una TSE in specie diverse dai bovini, ovini e caprini, questi comprendono almeno un esame istopatologico del tessuto cerebrale. L'autorità competente può richiedere inoltre test di laboratorio, quali immunoistochimica, Western blotting, dimostrazione delle caratteristiche fibrille mediante microscopia elettronica oppure altri metodi atti a individuare la forma della proteina prionica associata alla patologia. Almeno un altro esame di laboratorio deve essere comunque condotto qualora l'esame istopatologico iniziale sia negativo o non conclusivo. Nel caso della prima comparsa della malattia, devono essere eseguiti almeno tre esami diversi. In particolare, laddove si sospetti la BSE in una specie diversa dai bovini, i casi devono essere inoltrati al laboratorio UE di riferimento, assistito dallo STEG, per un'ulteriore caratterizzazione.

4. Test rapidi

Per eseguire i test rapidi di cui all'articolo 5, paragrafo 3, e all'articolo 6, paragrafo 1, sono utilizzati quali test diagnostici rapidi per la sorveglianza della BSE nei bovini solo i seguenti metodi:

test di immunocolorazione secondo la metodica Western blotting per l'individuazione del frammento PrPRes resistente alla proteinasi K (test Prionics Check Western),

immunodosaggio a «sandwich» per l'individuazione della PrPRes (short assay protocol), previa denaturazione e concentrazione (test rapido Bio-Rad TeSeE SAP),

immunodosaggio su micropiastra (ELISA) per l'individuazione della PrPRes resistente alla proteinasi K con anticorpi monoclonali (test Prionics-Check LIA),

immunodosaggio con impiego di un polimero chimico per la cattura selettiva della PrPSc e un anticorpo monoclonale di rilevazione diretto contro le regioni conservate della molecola della PrP (kit per il test dell'antigene della BSE IDEXX HerdChek, EIA e kit per il test dell'antigene della BSE/della scrapie IDEXX HerdChek, EIA (Laboratori IDEXX)],

immunodosaggio a flusso laterale con impiego di due diversi anticorpi monoclonali per individuare le frazioni della PrP resistenti alla proteinasi K (Prionics Check PrioSTRIP),

immunodosaggio a «sandwich» con impiego di due diversi anticorpi monoclonali diretti contro due epitopi presenti in una PrPSc bovina in uno stato altamente dispiegato (kit per il test Roboscreen Beta Prion BSE EIA).

Per eseguire i test rapidi di cui all'articolo 5, paragrafo 3, e all'articolo 6, paragrafo 1, sono utilizzati quali test diagnostici rapidi per la sorveglianza della TSE negli ovini e nei caprini solo i seguenti metodi:

immunodosaggio a «sandwich» per l'individuazione della PrPRes (short assay protocol), previa denaturazione e concentrazione (test rapido Bio-Rad TeSeE SAP),

immunodosaggio a «sandwich» per l'individuazione della PrPRes mediante il kit di individuazione TeSeE Sheep/Goat, previa denaturazione e concentrazione mediante il kit di purificazione TeSeE Sheep/Goat (test rapido Bio-Rad TeSeE Sheep/Goat),

immunodosaggio con impiego di un polimero chimico per la cattura selettiva della PrPSc e un anticorpo monoclonale di rilevazione diretto contro le regioni conservate della molecola della PrP [kit per il test dell'antigene della BSE/scrapie HerdChek (Laboratori IDEXX)],

Per tutti i test rapidi il campione di tessuto utilizzato deve risultare conforme alle istruzioni d'uso del fabbricante. I produttori dei test diagnostici rapidi devono essersi dotati di un sistema di assicurazione della qualità approvato dal laboratorio UE di riferimento ed essere in grado di garantire la stabilità dei risultati dei test. I produttori devono fornire i protocolli del test al laboratorio UE di riferimento. I test diagnostici rapidi e i relativi protocolli possono essere modificati solo previa comunicazione al laboratorio UE di riferimento e purché quest'ultimo concluda che la modifica non riduce la sensibilità, specificità o affidabilità del test rapido. Tale conclusione va comunicata alla Commissione e ai laboratori nazionali di riferimento.

5. Test alternativi

(Da definire)

Fonti e licenze